Elektroforese is een van de meest gebruikte instrumenten in de moleculaire biologie. Het wordt gebruikt om nucleïnezuur te scheiden. Elektroporatie is het proces waarbij nucleïnezuur wordt gescheiden op basis van grootte. Bij elektroforese wordt een gel gebruikt. Er worden putjes gemaakt in de gel waarin nucleïnezuurmonsters worden geladen. Elektrische stroom wordt doorgegeven en gebaseerd op de grootte van het nucleïnezuur in de gel. Het helpt bij het kwantificeren, scheiden en zuiveren van het nucleïnezuur.
Agarose versus polyacrylamide
Het verschil tussen agarose en polyacrylamide is dat agarose wordt gebruikt om grote DNA-fragmenten te scheiden, maar polyacrylamidegel wordt gebruikt om kortere eiwit- en nucleïnezuurfragmenten te scheiden. Agarose wordt horizontaal gegoten, terwijl polyacrylamide verticaal wordt gegoten. Agarose kan horizontaal worden verwarmd en gegoten, maar het breekt gemakkelijk, dus het moet voorzichtig worden behandeld.
Agarosegel wordt meestal gebruikt om elektroforese uit te voeren. Omdat het helpt om nucleïnezuur te scheiden op basis van de grootte, wordt het gebruikt om het onbekende DNA- of RNA-monster te identificeren. Hier wordt een ladder van bekende grootte gebruikt en de band van onbekende nucleïnezuur wordt vergeleken met de ladder en de grootte wordt geïdentificeerd.
Polyacrylamidegelelektroforese wordt PAGE genoemd. Het wordt vaak gebruikt om eiwitten te scheiden op basis van hun grootte. Deze elektroforese werkt op basis van het principe dat het geladen eiwit- of nucleïnezuurmonster door de gel migreert wanneer er een elektrisch veld wordt aangelegd. Omdat de mobiliteit van een biologisch molecuul verandert afhankelijk van de grootte en lading. Het gebruikte monster moet worden behandeld om een uniforme lading te bereiken, zodat de mobiliteit in principe afhangt van de grootte.
Vergelijkingstabel tussen agarose en polyacrylamide
| Parameters van vergelijking: | Agarose | Polyacrylamide |
| Toxiciteit | Niet giftig | Enigszins giftig |
| Porie grootte | Grotere poriën | Kleinere poriën |
| Toepassingen | Agarosegel wordt meestal gebruikt om DNA en RNA te scheiden | Polyacrylamidegel wordt gebruikt om eiwitten te scheiden en te kwantificeren |
| Gel gietpositie | Horizontale positie | Verticale positie |
| kleurstof | Ethidiumbromide | Broomfenol blauw |
| Hergebruiken | Agarose kan worden gesmolten en hergebruikt | Het wordt normaal niet hergebruikt |
Wat is Agarose?
Agarose is een biomolecuul dat wordt gebruikt om een gel te maken die een driedimensionale matrix is met poriën en kanalen. De driedimensionale matrix wordt bij elkaar gehouden door waterstofbruggen. Omdat er waterstofbruggen zijn, kan de matrixstructuur gemakkelijk worden gedenatureerd door verhitting. De biomoleculen van het monster bewegen door de poriën.
De smelttemperatuur van agar is 85-95 graden Celsius en de geleertemperatuur is 35-42 graden Celsius. Agarosegel wordt gemaakt door agarose met water te mengen en te smelten. Vervolgens wordt het horizontaal op een mal gegoten waarin een kam wordt geplaatst. Agarose koelt dan af en vormt een gel. De kam laat een putje achter waarin het monster kan worden geladen.
Agarosegel met een lage concentratie is vatbaar voor breuk. Er moet dus voorzichtig mee worden omgegaan. Agarose kan worden gebruikt om DNA en RNA te scheiden. De poriën in de agarosegel zijn veel groter om een bacteriofaag binnen te laten. Agarose is een polymeer met pyruvaat- en sulfaatgroepen. Omdat deze groepen negatief geladen zijn, veroorzaakt het de stroming van water in tegengestelde richting van die van de beweging van DNA.
De kleurstof ethidiumbromide wordt gebruikt om het DNA te kleuren, waardoor de grootte en lading van het monster verandert. Een bufferoplossing wordt in de opstelling gegoten en er wordt stroom doorgelaten waardoor het monster door de agarosegel beweegt en banden vormt.
Wat is Polyacrylamide?
Polyacrylamide is een synthetisch lineair polymeer dat bestaat uit acrylamide en acrylzuur. Polyacrylamide neemt actief water op en vormt een zachte gel. Het is een van de gels die bij elektroforese worden gebruikt. Eiwit en nucleïnezuur kunnen worden gekwantificeerd in polyacrylamidegel op basis van hun elektroforetische mobiliteit.
Polyacrylamidegel gemaakt door acrylamidehydratatie is goed omdat de poriegrootte kan worden geregeld afhankelijk van de hydratatie. Gel met een kleine poriegrootte is effectief bij het onderzoeken van kleinere moleculen. Grotere moleculen kunnen niet door kleine poriën bewegen en vast komen te zitten, terwijl kleinere moleculen gemakkelijk door poriën bewegen en banden vormen.
Polyacrylamidegel wordt vooral gebruikt in het SDS PAGE-experiment. SDS PAGE breidt uit als natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Het wordt gebruikt om eiwitmonsters te scheiden op basis van hun grootte. Natriumdodecylsulfaat is een detergens en bindt aan het eiwitmolecuul. Bij binding aan het eiwit vernietigt dit detergens de secundaire en tertiaire structuur van het eiwit en maakt het tot een lineaire polypeptideketen. Dit lineaire polypeptide is negatief geladen en reist naar de anode wanneer het wordt blootgesteld aan een elektrisch veld. Hier is de door het molecuul afgelegde afstand omgekeerd evenredig met de logaritme van het molecuulgewicht. Het wordt ook gebruikt om nucleïnezuurmonsters met een laag molecuulgewicht te onderzoeken.
Belangrijkste verschillen tussen agarose en polyacrylamide
Gevolgtrekking
Agarose en polyacrylamide zijn twee verschillende polymeren. Ze zijn chemisch verschillend. Hoewel ze beide worden gebruikt voor elektroforese, worden ze voor twee verschillende doeleinden gebruikt. Agarose heeft grotere poriën en wordt gebruikt om grotere nucleïnezuurmoleculen zoals DNA en RNA te scheiden. Polyacrylamide daarentegen heeft kleinere poriën en wordt gebruikt om eiwitten met een kleiner molecuulgewicht te scheiden en te kwantificeren.
Beide verbindingen dienen verschillende doelen en zijn zeer nuttig in de moleculaire biologie. Naast moleculaire biologie worden ze ook op veel andere gebieden gebruikt. Omdat deze gels helpen om het nucleïnezuur en eiwit te kwantificeren, hebben ze toepassingen in de geneeskunde en de forensische wetenschap.
